用熒光疊氮化物探針通過CuAAC可視化炔烴標(biāo)記的生物分子的一個(gè)主要缺點(diǎn)反應(yīng)是需要去除未反應(yīng)的熒光探針。當(dāng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、活體組織成像或?qū)w內(nèi)生物分子進(jìn)行可視化時(shí)，這尤其成問題。去除所有未反應(yīng)的熒光探針的困難也是背景信號(hào)和非特異性結(jié)合的主要原因之一。

為了克服這一缺點(diǎn)，Carolyn Bertozzi小組設(shè)計(jì)了熒光疊氮化物探針，通過銅催化或無(wú)金屬點(diǎn)擊化學(xué)。這些疊氮化物探針在與炔烴反應(yīng)之前不具有熒光性。已終止在CalFluor中，這些探針具有從綠色到遠(yuǎn)紅色波長(zhǎng)的發(fā)射最大值，并且能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏無(wú)洗滌條件下的生物分子檢測(cè)。許多報(bào)告表明，CalFluor探針是用于敏感可視化細(xì)胞中代謝標(biāo)記分子（聚糖、DNA、RNA和蛋白質(zhì)）的工具，正在開發(fā)在不洗滌的條件下將動(dòng)物腦組織切片、斑馬魚和小鼠腦組織切片。